Исследование токсического и генотоксических эффектов синтетических пищевых красителей методом Allium test

Д. С. Песня, А. В. Романовский, И. М. Прохорова

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает, что исследования токсических и генотоксических эффектов имеют большое значение, поскольку в последнее время участились случаи мер- творождений и появления у новорожденных различныхуродств. Возросла распространенность злокачественных заболеваний, аллергозов и других патологий. Все это обусловливает актуальность изучения пищевых добавок как одного из факторов, воздействующих на человека. Согласно ВОЗ решающее значение имеют исследования именно

Введение

Наряду с загрязнением окружающей среды, следует выделить один из самых важных факторов, влияющих на состояние здоровья человека и его популяции в целом, - фактор питания. Пища современного человека является не только носителем пластических и энергетических материалов, но и источником компонентов неалиментарного (непищевого) характера, среди которых много компонентов антропогенного происхождения. Важнейшую группу подобных чужеродных веществ пищи составляет огромное количество пищевых добавок [1].

Среди них широкое распространение в пищевой промышленности получили различные красители. Их используют повсеместно для улучшения внешнего вида продуктов питания. Например, конфеты (сахарное драже, мармелад и т. д.) очень популярны среди детского контингента. Родители охотно покупают их для детей, а именно организм ребенка является очень уязвимым для химикатов, которые входят в состав сладостей.

В связи с вышесказанным целью настоящей работы являлось исследование токсического, митозмодифицирующего и мутагенного действия различных синтетических пищевых красителей, входящих в состав детского сахарного драже.

Материалы и методы исследования

Материалом исследования являлся детский набор разноцветного сахарного драже с игрушкой. Производитель Xiamen Ying Wan Foodstuff Co. Ltd. (Китай, сайт производителя: http://www.en-one.com/jelly-bean). Исследовалось драже красного, оранжевого, желтого, зеленого, голубого и белого цвета. Состав, заявленный производителем, - это сахар; сироп глюкозы; желатин; регуляторы кислотности (лимонная кислота, цитрат натрия); ароматизатор идентичный натуральному; пищевые красители: красный (Красный Очаровательный АС - E129), оранжевый (Желтый «Солнечный закат» - E110), желтый (Тартразин - E102), зеленый (Зеленый S - E142), синий (Бриллиантовый Голубой FCF - E133), белый (Диоксид титана - E171).

Для изучения действия пищевых красителей был выбран Allium test, который рекомендован экспертами Всемирной организации здравоохраниения как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды. Результаты, полученные в данном тесте, хорошо коррелируют с результатами тестов на клетках млекопитающих и человека (корреляция до 82 %) [5, 6]. Объектом исследования в данном тесте является меристема проростков корешков лука посевного - Allium cepa сорта Штут- гартен-Ризен [2, 6, 7]. Ряд авторов рекомендует использовать Allium test для изучения токсического, митозмодифицирующего и мутагенного действия пищевых добавок [8, 9]. Например, генотоксичность тартразина уже исследовалась в Allium test [8].

Выбранная растительная тест-система экономична, так как на ней (в отличие от микроорганизмов) можно регистрировать все типы генетических повреждений: геномные, хромосомные, генные. Она позволяет выявлять как мутагены, непосредственно повреждающие ДНК, так и промутагены, то есть факторы генетически безопасные, но приобретающие мутагенную активность в процессе метаболизма в организме [2].

Постановка опыта

Брали навеску в 1 г сахарного драже каждого цвета и растворяли в 100 мл дистиллированной воды (концентрация 1 %). Готовили вторую концентрацию 0,2 % (0,2 г на 100 мл воды). Таким образом, получилось шесть пар растворов разных цветов, или 12 опытных вариантов.

Луковицы A. cepa помещались в стаканчики на 25 мл с растворами драже. Всего было поставлено четырнадцать вариантов опытов, различающихся по типу (цвету) красителя и концентрации, включая два контрольных варианта: контроль на дистиллированной воде и на 1 % растворе сахара в дистиллированной воде, чтобы проверить действие сахара на корневые меристемы A. cepa.

Для каждого варианта использовали повторности в соответствии с рекомендациями современного стандарта на проведение экспериментов по методу Allium test (по три луковицы для каждого варианта) [5]. Луковицы проращивали 4 дня. Затем у каждой луковицы корни срезали под основание донца.

1. Для оценки токсического действия определяли длину корней. Изменение длины корней в Allium test является показателем токсичности изучаемого фактора и используется в качестве краткосрочного скриннинг-теста [6]. Данный тест можно проводить в широком диапазоне рН (3,5-11), в пределах которого не наблюдается каких-либо эффектов на росте корневой системы A. cepa [6]. Измеряли длину каждого корешка. Определялось среднее арифметическое (X) и ошибка среднего (m) для варианта опыта. После измерений корни фиксировали в фиксаторе Кларка [2]. Для цитогенетического анализа готовили препараты (по 9 препаратов на вариант опыта) давленых корневых меристем, согласно методике [2, 3].

2. Показателем митозмодифицирующего действия фактора является митотический индекс (MI, %) [2]. Он определяется как отношение числа делящихся клеток к общему числу рассмотренных на препарате клеток [2]. В ходе данного анализа на препаратах под микроскопом просматривали около 700-800 клеток. Среди них подсчитывали количество делящихся клеток, которые находились на разных стадиях митоза, и число не делящихся клеток (интерфаз).

Чтобы вскрыть причины изменения митотической активности, анализировали продолжительность каждой фазы митоза и определяли фазные индексы. Фазные индексы (ПИ, % - профаз- ный индекс; МИ, % - метафазный; АИ, % - анафазный; ТИ, % - телофазный) определяются как количество клеток, которые находятся на стадии профазы, метафазы и т. д., к общему количеству проанализированных митозов [2]. Проводили сравнение долей различных фаз в контрольном и опытных вариантах.

3.Мутагенное действие определяли с использованием ана-телофазного анализа [2], позволяющего изучать частоту мутаций путем учета суммы хромосомных аберраций (ХА) и отставаний хромосом (отс.) на стадиях анафазы и телофазы к общей сумме ана-телофаз на препарате(Еотс.+ХА, %) [2]. Хромосомные аберрации - нарушения структуры хромосом - включают мосты и фрагменты, являющиеся следствием делеций и транслокаций. Отставания хромосом связаны с повреждением веретена деления или с нарушением поведения хромосом на веретене деления [2].

Степень мутагенного эффекта оценивали по ВМЭ (выраженности мутагенного эффекта) [2]. ВМЭ определяется как кратность превышения процента индуцированных мутаций над контрольным значением (спонтанным уровнем) и выражается в баллах. Баллы ВМЭ ранжировали по уровням мутагенного эффекта и классифицировали как сильный, средний, слабый или отсутствие [2].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного пакета “Statistica” (t-test и ANOVA). За уровень значимых принимали значения при p<0,05 (*).

Результаты экспериментов:

Токсический эффект пищевых красителей

Полученные нами данные представлены в табл. 1. Достоверный токсический эффект регистрируется во всех вариантах опыта, кроме контрольных. Наибольший токсический эффект был зарегистрирован в варианте опыта с красителем Бриллиантовый Голубой FCF (E133), Диоксид титана (E171), Зеленый S (E142). Минимальный токсический эффект - в варианте с красителем Тартразин (желтый цвет, E102) и Красный Очаровательный АС (E129).

Митозмодифицирующий эффект пищевых красителей

Причиной угнетения роста корней может являться подавление пролиферативной активности клеток, то есть митотоксичность. Анализ митотической активности позволил зарегистрировать митотоксический эффект во всех опытных вариантах, за исключением E129 при концентрации 0,2 % (табл.

1). При митотоксическом эффекте доля клеток, которые находятся в митозе, резко падает. Максимальный митотоксический эффект был обнаружен в варианте с добавлением красителей E133 и E171.

Как видно в табл. 1, при концентрации 0,2 % наблюдается статистически достоверное угнетение профазного индекса во всех вариантах, кроме вариантов с E129 и E110. Это соответствует полученным нами данным по значению митотического индекса при концентрации 0,2 %. Угнетение профаз- ного индекса свидетельствует о том, что меньше клеток вступило в митоз, а также о том, что угнетение корневого прироста и уменьшение митотического индекса связано с угнетением процессов подготовки клетки к делению.

В табл. 1 представлены значения фазных индексов при концентрации пищевых красителей 1 %. Как видно, угнетение профазного индекса более значительно и статистически достоверно во всех опытных вариантах. При этом минимальные значения ПИ, % наблюдаются после воздействия растворов, содержащих синий (E133), белый (E171) и зеленый (E142) красители. Соответствующая картина наблюдается и по значению митотического индекса (конц. 1 %), который принимает минимальные значения после воздействия синего, белого и зеленого красителей. Максимальный митоток- сический эффект по показателю митотического и фазных индексов проявляет синий краситель (Бриллиантовый Голубой FCF, E133).

Значение метафазного индекса при конц. 0,2 и 1 %, как видно в табл. 1, достоверно возрастает по сравнению с контрольными вариантами во всех опытных вариантах, кроме варианта с E129. Увеличение метафазного индекса по сравнению с контрольным вариантом свидетельствует о том, что синтетические пищевые красители нарушают цитоскелет клетки и мешают формированию веретена деления, что выражается в появлении патологических митозов.

Наиболее выражено увеличение метафазного индекса после воздействия E133 и E129 в концентрациях 1 и 0,2 %. Следует отметить, что это сопоставимо с проведенными микроскопическими исследованиями. Именно после воздействия синего и зеленого красителей нами зарегистрированы нарушения в расхождении хромосом на стадии метафазы. Пример приведен на рис. 1.

Рис. 1. Нарушение ахроматинного веретена на стадии метафазы после воздействия красителями Зеленый S и Бриллиантовый Голубой FCF (а - норма, б - патология)

Данные по средней длине корешков, значению митотического и фазных индексов в контроле и при различных концентрациях экстракта H. sosnowskyi

Таблица 1

Мутагеный эффект пищевых красителей

При концентрации пищевых красителей 1 % во всех опытных вариантах зарегистрировано достоверное увеличение частоты хромосомных аберраций и отставаний по сравнению с контрольным уровнем (табл. 2). При концентрации 0,2 % достоверного увеличения частоты хромосомных аберраций и отставаний не отмечается только в варианте с красным красителем. Среди всех шести опытных вариантов с красителями наи-

более резко выделялись мутагенной активно- леный S, E142), желтого (Тартразин, E102) и сине- стью при любых концентрациях три варианта, го цвета (Бриллиантовый Голубой FCF, E133). в которых использовалось драже зеленого (Зе-

Таблица 2

Данные по частоте хромосомных аберраций и отставаний (Еотс.+ХА, %) и уровням мутагенного эффекта

Условные обозначения: © - отсутствие мутагенного эффекта, © - слабый мутагенный эффект, © - средний мутагенный эффект, Ж - сильный мутагенный эффект.

Наиболее характерные типы хромосомных аберраций, которые наблюдались после воздействия красителей Бриллиантовый Голубой FCF, Зеленый S и Тартразин, представлены на рис. 1, 2, 3 и 4 в сравнении с контролем. Справа в анафазе видно грубое нарушение структуры хромосом, которое выделяется наличием сразу нескольких мостов, образовавшихся в результате таких хромосомных мутаций, как транслокации и делеции (рис. 2-б). А слева в телофазе наблюдается двойной фрагмент (рис. 2-б). В варианте с зеленым драже (Зеленый S), помимо хромосомных аберраций и отставаний хромосом была зарегистрирована деструкция интерфазного хроматина (рис. 4), что свидетельствует о повреждении не делящихся клеток. Кроме того, после воздействия Тартразина и Зеленого S отмечалось появление микроядерных мутаций (рис. 3).

Микроядра являются предвестниками онкологических болезней и клеточной смерти. Если такие клетки не апоптируют, то могут переродиться в раковые [9].

В данном эксперименте оценивалась суммарная мутагенная активность всех компонентов сахарного драже. Как видно в табл. 2, различия в мутагенной активности обусловлены видом синтетического красителя, входящего в состав сахарного драже (все остальные компоненты одинаковы).

При этом, вероятно, мутагенный эффект продукта обусловлен не только самими красителями, но и их совместным или синергетическим действием с другими компонентами драже (ароматизатор, консервант, стабилизатор).

Таким образом, все исследованные варианты детского сахарного драже проявляют токсическое, митотоксическое и мутагенное действие в данной тест-системе. Характер и величина эффектов зависят от типа красителя и концентрации.

Рис. 2. Характерные типы хромосомных аберраций для красителей: б - множественные мосты и забегания хромосом, индуцированные Зеленым S (E142), и г - фрагментация хромосом, вызванная Тартразином (E102);

а и в - норма (анафаза и телофаза соответственно)

Рис. 3. Появление сестринских микроядер (в двух центральных клетках) после воздействия на меристему пищевых красителей Зеленый S (E142) и Тартразин (E102)

Рис. 4. Деструкция интерфазного хроматина в виде выпячиваний содержимого ядра “nuclear budding” после воздействия пищевым красителем Зеленый S (E142)

Выводы

Проведено исследование токсического, ми- тозмодифицирующего и мутагенного действия детского набора сахарного драже с игрушкой, содержащего различные синтетические красители: Красный Очаровательный АС (E129), Желтый «Солнечный закат» (E110), Тартразин (E102), Зеленый S (E142), Бриллиантовый Голубой FCF (E133), Диоксид титана (E171). Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. Все изученные виды синтетических пищевых красителей угнетают прирост корешков у A. oepa, что свидетельствует о токсической активности всех исследованных красителей.

2. Все исследованные виды синтетических пищевых красителей снижают митотический индекс до 2,0±0,27 % при контрольном уровне 10,6±0,56 %, что свидетельствует о митоток- сической активности данных красителей.

3. Все исследованные виды синтетических пищевых красителей вызывают хромосомные мутации или обладают мутагенной активностью: увеличивают частоту хромосомных аберраций и отставаний до 11,4±1,63 %, что превышает контрольный уровень (0,7±0,31 %) в 16 раз. Уровень мутагенного эффекта классифицируется как сильный.

4. Уровень наблюдаемых эффектов возрастает при увеличении концентрации красителей в растворе - эффект зависит от дозы.

5. Исследованные красители обладают токсической и генотоксической активностью, а следовательно, продукты с такой добавкой могут представлять опасность для здоровья человека, и особенно детей. Наиболее высокую генотоксическую опасность представляют красители: желтый - Тартразин (E102), зеленый - Зеленый S (E142) и синий - Бриллиантовый Голубой FCF (E133).

Allium test может быть рекомендован для оценки токсического, митозмодифицирующего и мутагенного потенциала пищевых добавок и синтетических красителей.

Список литературы

1. Булдаков, А. С. Пищевые добавки. Справочник оз. Неро [Текст] / И. М. Прохорова и др. - М. : Наука, [Текст] / А. С. Булдаков. - СПб. : «Ut», 1996. - 240 с.2008. - 59 с.

2. Прохорова, И. М. Пространственная и3. САНПИН2.3.2.1293-03 (с изменениями от временная динамика мутагенной активности воды 26.05.2008 и 27.04.2009). URL : http://www.alphavit.ru//regulations/additives/2_3_2_1293 _03.pdf или http://goo.gl/IUaTx

4. Amin K.A., Abdel Hameid II H., Abd Elsttar A.H. Effect of food azo dyes tartrazine and carmoisine on biochemical parameters related to renal, hepatic function and oxidative stress biomarkers in young male rats / K.A. Amin et al. // Food and Chemical Toxicology. - 2010. - Vol. 48. - P. 2994-2999.

5. Barberrio A., Voltolini J. C., Mello M. L. S. Standardization of bulb and root sample sizes for the Allium test / A. Barberrio, J. C. Voltolini, M. L. S. Mello // Ecotoxicology. - 2011. - Vol. 20. - P. 927-935.

6. Fiskesjo G. The Allium test as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. - 1985. - Vol. 102. - P. 99-112.

7. Levan A. The influence on chromosomes and mitosis of chemicals, as studied by the Allium test / A. Levan // Hereditas. - 1949. - Vol. 35. - P. 325-337.

8. Roychoudhury A., Giri A. K. Effects of certain food dyes on chromosomes of Allium cepa // Mutat. Res. - 1989. - Vol. 223. - P. 313-319.

9. Turkoglu S. Evaluation of genotoxic effects of sodium propionate, calcium propionate and potassium propionate on the root meristem cells of Allium cepa [Text] / S. Turkoglu // Food and Chem. Toxicol. - 2008. - Vol. 46. - P. 2035-2041.