Фотосинтетический кислород: роль H₂ O₂

По современным представлениям фотосинтетический кислород выделяется из воды. Имеется ряд соединений, аналогов H₂ O, взаимодействующих с водоокисляющим комплексом. Среди них особый интерес представляет пероксид водорода в связи с его возможным участием в фотосинтетическом выделении O₂ . Существуют предположения об H₂ O₂ как промежуточном продукте окисления H₂ O и даже как об исходном субстрате-доноре электронов. У некоторых цианобактерий и водорослей выделение O₂ прекращается в анаэробных условиях. Исследования роли H₂ O₂ в фотосинтетическом выделении O₂ представляются перспективными.

According to current views, the photosynthetic oxygen is evolved from the water. There is a number of compounds, of the H₂ O analogues, interacting with the water-oxidizing complex. Among these compounds, of particular interest is hydrogen peroxide as a possible participant in photosynthetic O₂ evolution. There are the assumptions of H₂ O₂ as an intermediate in H₂ O oxidation and, moreover, as the starting electron donor substrate. In several cyanobacteria and algae, O₂ evolution in the light is ceased under the anaerobic conditions. The elucidation of the H₂ O₂ role looks promising for the studies on photosynthetic O₂ evolution.

Фундаментальная проблема биохимии - механизм фотосинтетического выделения кислорода. Проблема не нова, возникла со времен Джозефа Пристли, открывшего в 1771 г. фотосинтетический кислород. Важность ее решения трудно переоценить: космическая роль зеленого листа по К.А.Тимирязеву заключается в фотосинтезе органических веществ и молекулярного кислорода - субстратов, обеспечивающих жизнедеятельность хемотрофных организмов. Проблема фотосинтетического кислорода имеет комплексный характер, исследования ведутся во многих лабораториях мира. В последние годы в решении проблемы наметился определенный прогресс. Наряду с фундаментальностью, проблема имеет и прикладную перспективу, в частности, ее решение позволило бы использовать принципы фотосинтетического механизма для получения из воды молекулярного водорода в качестве энергоносителя.

По современным представлениям фотосинтетический кислород выделяется из воды [1]. Фотосистема (ФС) II хлоропластов и цианобактерий функционирует как H2O:пластохинон-оксидоредуктаза [2]:

H₂ O → (Mn)₄ → Y_Z → P680 → Фео → Q_A → Q_B Q_P → Q_Z (b₆ f ),

где (Mn)₄ - четырехъядерный Mn-кластер водоокисляющего комплекса (ВОК), Y_Z - остаток тирозина-161 в полипептиде D1 фотосистемы II, P680 - реакционный центр ФСII, Фео - промежуточный акцептор электронов (феофитин), Q_A и Q_B - первичный и вторичный пластохиноны, Q_P - мембранный фонд пластохинона, Q_Z - участок связывания пластохинона в b₆ f -цитохромном комплексе.

Окисление H₂ O включает четыре одноэлектронные стадии, приводящие к последовательному накоплению окислительных эквивалентов в Mn-кластере. Соответственно, Mn-кластер может находиться в пяти различных окислительно-восстановительных состояниях, обозначаемых символами S₀ -S₄ . Состояния S₀ и S₁ стабильны в темноте, S₄ превращается в S₀ сопряженно с выделением O₂ , состояния S₂ и S₃ не устойчивы и релаксируют в темноте в состояние S₁ за десятки секунд. В темноте соотношение S₁ : S₀ составляет 3-4, поэтому в условиях импульсного освещения, когда каждая световая вспышка вызывает один оборот P680, максимальный выход O₂ из H₂ O наблюдается в ответ на третий импульс; на первый импульс O₂ не выделяется.

Данные структурных исследований позволяют предположить, что (Mn)₄ представляет собой димер из двух биядерных центров. Это согласуется с данными о функциональной неоднородности четырех Mn-центров (см. [3] и цитированную там литературу). Одна из (Mn)₂ -групп, (Mn-Mn)_ВОК , образует каталитический центр ВОК; другая, (Mn-Mn)_C , по-видимому, служит регулятором функциональной активности (Mn-Mn)_ВОК . Существует ряд соединений, аналогов H₂ O, взаимодействующих с ВОК. Так, окисление NH₂ OH и NH₂ NH₂ ведет к образованию сверхвосстановленных состояний (Mn)₄ -кластера - состояний S_-1 и S_-2 [3]: протекают реакции S₁ → S_-1 и S₂ → S_-2 , которые в рамках представлений о биядерных (Mn)₂ -группах могут соответствовать переходам:

и

Особый интерес среди аналогов H₂ O представляет пероксид водорода. В присутствии H₂ O₂ хлоропласты выделяют O₂ в ответ на первый световой импульс [4]. Этот результат подтвержден в опытах с H₂ ¹⁸ O₂ [5]. В темноадаптированных тилакоидах хлоропластов H₂ O₂ вызывает переход S₁ → S_-1 [4, 5]. При этом устанавливается соотношение S₀ : S_-1 : S₁ , близкое к 0 : 6 : 4 [5]. Состояние S_-1 стабильно и не релаксирует, по меньшей мере, в течение 15 мин [5]. Одиночный световой импульс вызывает переход S_-1 /S₁ → S₀ /S₂ , который инициирует темновую реакцию окисления H₂ O₂ с образованием O₂ [4,5]. Как продемонстрировано в опытах с H₂ ¹⁸ O₂ , весь O₂ выделяется из H₂ O₂ [5], в расчете на 1 P680 после одиночной вспышки света выделяется более 20 молекул O₂ . Эта реакция, подобная каталазной реакции, предположительно обусловлена восстановлением S₂ до S₀ посредством H₂ O₂ (E₀ ' для O₂ /H₂ O₂ равен 0,295 В) и последующим H₂ O₂ -зависимым окислением S₀ до S₂ (E₀ ' для H₂ O₂ /H₂ O равен 1,42 В). Реакции S-состояний, вызываемые H₂ O₂ , иллюстрирует схема (по [5]).

Переходы S₂ → S₁ и S₀ S_-1 приводят к постепенному затуханию темнового выделения O₂ из H₂ O.

Имеются данные о том, что выделение O₂ из H₂ O₂ в результате циклического перехода S₂ → S₀ → S₂ возможно без предварительного воздействия одиночным световым импульсом [6-8]. Процесс зависит от (Mn)₄ , Ca²⁺ и Cl^- [6]. Эти данные, однако, подвергнуты критике [9]. В частности, комплексы ФСII, лишенные субъединиц ВОК с молекулярной массой 17 и 24 кДа ( на которых проводились опыты [6-8]), по данным работы [10] при воздействии H₂ O₂ теряют Mn, а по данным работы [8] полностью сохраняют его и при этом характеризуются отсутствием шестиполосного сигнала ЭПР от Mn²⁺ , находящегося в водном окружении. Утверждается [9], что такой сигнал в условиях комнатной температуры, в которых проводились измерения [8], должен регистрироваться и в образцах с нативным Mn-кластером ВОК. Тилакоидные мембраны, обедненные Cl^- , не способны к фотоокислению H₂ O, но выделяют O₂ из H₂ O₂ на свету [11]. Опыты с антибиотиком A23187 (осуществляющим трансмембранный обмен двухвалентных катионов на 2H+) и данные о действии добавленного Mn²⁺ склонили авторов работы [11] к предположению о том, что фотоокисление H₂ O₂ в таких мембранах катализируется свободным или лабильно связанным Mn, возникающим в результате H₂ O₂ -зависимой деструкции (Mn)₄ , входящего в состав ВОК. Добавленный Mn2+ поддерживает окисление H₂ O₂ в тилакоидных мембранах, обогащенных ФСII и предварительно лишенных Mn [12].

Таким образом, к настоящему времени нет ясности по вопросу, нужен ли для выделения O₂ из H₂ O₂ интактный ВОК. Или этот процесс протекает и после деструкции ВОК? В этом случае пути окисления H₂ O и H₂ O₂ расходятся, и тогда изучение разложения H₂ O₂ в качестве подхода для познания механизма выделения O₂ из H₂ O теряет смысл.

Однако имеются данные, полученные с применением другого подхода. В определенных условиях электрон-донорная ветвь ФСII может генерировать H₂ O₂ . Образование H₂ O₂ на свету вызывают ADRY-реагенты (ADRY - от английского "Acceleration of Deactivation Reactions of the Water-Oxidizing Complex Y", см. [2] в качестве обзора) [13] - соединения, которые, окисляясь, ускоряют дезактивацию S₂ - и S₃ -состояний с образованием S₁ . H₂ O₂ образуется в вывернутых тилакоидных мембранах, если они лишены 16- и 23 кДа-полипептидов ВОК [14]. Процесс зависит от добавленного Mn²⁺ и подавляется ЭДТА. Освещение мембран, обогащенных ФСII в результате обработки детергентом, тоже приводит к образованию H₂ O₂ [15, 16], как предполагают авторы, в электрон-донорной ветви ФСII.

H₂ O₂ , образованный в электрон-донорной ветви ФСII, высвобождается лишь при кислотной обработке мембран - при снижении pH до 1,4 [15]. Связанный H₂ O₂ образуется на первую вспышку света, на последующие вспышки наблюдаются осцилляции с периодом в два такта: на нечетные вспышки H₂ O₂ образуется, а на четные - исчезает. Выход связанного H₂ O₂ составляет 0,35 моль на 1 моль P680. Связанный H₂ O₂ образуется и в мембранах, лишенных Mn, но без осцилляций на последовательные вспышки света [15].

Условием образования H₂ O₂ по данным работы [16] является помещение мембран в гипотоническую среду с низкой концентрацией сахарозы. Если в качестве акцептора электронов в реакции Хилла использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДФИФ), то количество фотовосстановленного ДФИФ в расчете на электронные эквиваленты более чем в 1,5 раза превышает количество выделенного O₂ . Разница стирается при добавлении каталазы [16]. Это свидетельствует о том, что значительная доля электронного транспорта через ФСII имеет результатом не выделение O₂ , а образование H₂ O₂ [16]. Предлагаются два возможных варианта объяснения полученных результатов [16]: образование H₂ O₂ как промежуточного продукта на пути окисления H₂ O до O₂ или как продукта, возникающего в результате замыкания цикла S-состояний (S₂ - или S₃ -состояния Mn-кластера релаксируют соответственно в S₀ или S₁ с высвобождением H₂ O₂ ).

Таким образом, и этот подход не дает однозначных результатов относительно роли H₂ O₂ в фотоокислении H₂ O. Более того, при одноэлектронном восстановлении O₂ компонентами электрон-акцепторных ветвей ФСII и ФСI образуется O₂ -. (см. [17] и цитированную там литературу). В изолированных хроматофорах пурпурных бактерий окисляется вторичный хинон, наиболее вероятно, в форме семихинона [18, 19]. При обработке хроматофоров детергентами с O₂ взаимодействует бактериофеофитин [20]. В модельных системах кислородом окисляются фотовозбужденные хлорофилл а и бактериохлорофилл а [21, 22]. Комплексы ФСII обладают высокой активностью супероксиддисмутазы [17], катализирующей реакцию:

2O₂ ^-. + 2H⁺ → H₂ O₂ + O₂ .

Применение еще одного подхода, "эволюционного", к проблеме фотосинтетического кислорода представляется перспективным. Эволюционно творцами оксигенного фотосинтеза стали цианобактерии. Многие из них образуют на свету H₂ O₂ [23]. Перенос электронов на O₂ с последующим образованием H₂ O₂ у цианобактерии Microcoleus chtonoplastes достигает 40% общего потока электронов через ФСII [24]. Исследованная цианобактерия имеет высокую активность супероксиддисмутазы и не содержит каталазы [24].

В условиях импульсного освещения изолированные тилакоиды Oscillatoria chalybea выделяют O₂ в ответ на первую световую вспышку (см. [25] и цитированную там литературу). Такие же данные получены с представителями Synechocystis и Synechococcus . Масс-спектрометрический анализ показал, что освещение мембран O. chalybea в присутствии H₂ ¹⁸ O₂ или ¹⁸ O₂ в газовой фазе приводит к выделению ¹⁸ O₂ . Сделан вывод о том, что ¹⁸ O₂ , добавленный в газовую фазу, растворяется в водной фазе, поглощается мембранами и превращается в компонент, который окисляется при освещении с выделением ¹⁸ O₂ . Данные изотопного распределения (¹⁶ O₂ , ¹⁶ O¹⁸ O, ¹⁸ O₂ ) показывают, что кислород выделяется не из H₂ ¹⁸ O, поскольку сигнал ¹⁶ O¹⁸ O, который неизбежно должен возникать при окислении воды, невелик. Следовательно, ¹⁸ O₂ выделяется из H₂ ¹⁸ O₂ , образующегося в результате темнового поглощения ¹⁸ O₂ из газовой фазы [25]. Фотоокисление воды у O. chalybea тоже происходит, но доля H₂ O в светозависимом выделении O₂ значительно ниже, чем доля H₂ O₂ . В анаэробных условиях выход O₂ на свету существенно снижается, при этом подавляется выделение O₂ из H₂ O₂ , но не из H₂ O [25]. Анаэробиоз ингибирует также фотовыделение O₂ зеленой водорослью Ulva sp. [26].

Таким образом, для фотосинтетического выделения O₂ указанными организмами требуется, чтобы в среде содержался O₂ , наиболее вероятно, как субстрат для образования H₂ O₂ . Предполагается, что H₂ O₂ является эволюционным предшественником H₂ O в качестве донора электронов для ФСII [25].

Более того, выдвинуто предположение [27], что в ходе современного фотосинтеза O₂ выделяется не из H₂ O, а из H₂ O₂ экзогенного и эндогенного (внутриклеточного) происхождения.

Процессы образования H₂ O₂ в атмосфере и природных водоемах, а также в клетках микроорганизмов подробно рассмотрены в обзоре [28]. Отметим лишь, что согласно расчетам [28] на каждый квадратный метр поверхности суши и океанов за год с осадками выпадает ~ 200 г H₂ O₂ [28], до 15% O₂ , потребляемого организмом животного, превращается в H₂ O₂ [29]. Генераторами H₂ O₂ в фотосинтезирующей клетке являются тилакоидные мембраны, митохондрии, пероксисомы, эндоплазматический ретикулум. Концентрация H₂ O₂ в водоемах в среднем составляет 10^-6 М [28]. Для использования в фотосинтезе маловато. Поэтому предполагаются механизмы концентрирования H₂ O₂ в клетке, например, в результате транспирации [27]. Напомним, что концентрация CO₂ в воздухе тоже невелика - 0,03%.

Если H₂ O₂ принять в качестве эволюционного предшественника H2O как донора электронов при фотосинтезе, то для образования H₂ O₂ был необходим O₂ . Мог ли O₂ появиться в добиогенный период развития Земли? Кислород современной земной атмосферы на 2,3% тяжелее кислорода, образующегося фотосинтетически [30]. Следовательно, помимо фотосинтеза должен быть другой источник O₂ , поставляющий его в атмосферу. "...свободный кислород в газовой фазе появился на Земле в глубокой древности, т.е. в раннем докембрии, в результате дегазации базальтовой магмы, подобно тому как появились в атмосфере и другие газы. Более того, он продолжает поступать из земных недр до настоящего времени. Магма является тем первым мощным источником кислорода в природе, который определяет количество и качество его в атмосфере совместно с появившимся несколько позднее кислородом фотосинтетическим" ([30], стр. 10). Кислород современной атмосферы на 30% имеет фотосинтетическое и на 70% геологическое (из земных недр) происхождение [30]. По данным минералогии, как было отмечено В.Н.Вернадским [31], в пределах научно изученных геологических периодов состав воздуха не менялся.

Рассмотренные данные показывают, что H₂ O₂ , возможно, играет важную роль в системе фотосинтетического выделения O₂ , однако эти данные не поддаются однозначной интерпретации. H₂ O₂ - промежуточный продукт окисления H₂ O или исходный субстрат-донор электронов? Пока нельзя даже ответить на вопрос: H₂ O₂ - это хорошо или плохо для фотосинтеза? Имеются данные о пагубном действии H₂ O₂ . H₂ O₂ , образующийся как в электрон-донорной, так и в электрон-акцепторной ветви ФСII, вызывает фотоингибирование ВОК [32].

Таким образом, представление о воде как доноре электронов и источнике кислорода при фотосинтезе не является однозначным. В последние годы появились данные об участии H₂ O₂ в фотосинтетическом выделении O₂ . Исследования в этой области представляются перспективными.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грантом 94-04-12227-а).

Список литературы

1. Самуилов В.Д. (1993) Биохимия , 58,1481-1485.
2. Самуилов В.Д., Киташов А.В. (1996) Биохимия , 61, 404-411.
3. Messinger, J., and Renger, G. (1993) Biochemistry , 32, 9379-9386.
4. Velthuys, B., and Kok, B. (1978) Biochim. Biophys. Acta , 502, 211-221.
5. Mano, J., Takahashi, M., and Asada, K. (1987) Biochemistry , 26, 2495-2501.
6. Frasch, W.D., and Mei, R. (1987) Biochim. Biophys. Acta , 891, 8-14.
7. Frasch, W.D., and Mei, R. (1987) Biochemistry , 26, 7321- 7325.
8. Frasch, W.D., Mei, R., and Sanders, M.A. (1988) Biochemistry , 27, 3715-3719.
9. Debus, R.J. (1992) Biochim. Biophys. Acta , 1102, 269-352.
10. Ghanotakis, D.F., Topper, J.N., and Yocum, C.F. (1984) Biochim. Biophys. Acta , 767, 524-531.
11. Sandusky, P.O., and Yocum, C.F. (1988) Biochim. Biophys. Acta , 936, 149-156.
12. Klimov, V.V., Allakhverdiev, S.I., Shuvalov, V.A., and Krasnovsky, A.A. (1982) FEBS Lett ., 148, 307-312.
13. Sayre, R.T., and Homann, P.H. (1979) Arch. Biochem. Biophys ., 196, 525-533.
14. Schroder, W.P., and Akerlund, H.-E. (1986) Biochim. Biophys. Acta , 848, 359-363.
15. Ананьев Г.М., Климов В.В. (1988) Докл. АН СССР , 298, 1007-1011.
16. Wydrzynski, T., Angstrom, J., and Vanngard, T. (1989) Biochim. Biophys. Acta , 973, 23-28.
17. Ananyev, G., Renger, G., Wacker, H., and Klimov, V.V. (1994) Photosynth. Res ., 41, 327-338.
18. Remennikov, V.G., and Samuilov, V.D. (1979) Biochim. Biophys. Acta , 546, 220-235.
19. Remennikov, V.G., and Samuilov, V.D. (1979) Arch. Microbiol ., 123, 65-71.
20. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. (1980) Докл. АН СССР , 252, 491-494.
21. Abdourashitova, F.D., Barsky, E.L., Gusev, M.V., Il'ina, M.D., Kotova, E.A., and Samuilov, V.D. (1984) Photobiochem. Photobiophys ., 8, 133-142.
22. Барский Е.Л., Камилова Ф.Д., Ременников В.Г., Самуи-лов В.Д. (1986) Биофизика , 31, 789-792.
23. Stevens, S.E., Patterson, C.O.P., and Myers, J. (1973) J. Phycol ., 9, 427-435.
24. Дубинин А.В., Застрижная О.М., Гусев М.В. (1992) Микробиология , 61, 384-389.
25. Bader, K.P. (1994) Biochim. Biophys. Acta , 1188, 213-219.
26. Popovic, R., Swenson, S.I., Colbow, K., Vidaver, W.E., and Bruce, D. (1987) Photosynthetica , 21, 165-174.
27. Комиссаров Г.Г. (1995) Хим. физика , 14, 20-28.
28. Штамм Е.В., Пурмаль А.П., Скурлатов Ю.И. (1991) Успехи химии , 60, 2373-2411.
29. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., and Chance, B. (1975) Biochem J ., 146, 67-73.
30. Бгатов В.И. (1985) История кислорода земной атмо-сферы . Недра, Москва.
31. Вернадский В.Н. (1955) Избр. соч ., Т. 2, Изд-во АН СССР, Москва, с. 448.
32. Bradley, R.L., Long, K.M., and Frash, W.D. (1991) FEBS Lett ., 286, 209-213.