Содержание
Репликация, сохранение и модификация генома
1. Репликация ДНК
а. Матричная функция ДНК при репликации
б. Репликация начинается в определенных точках
в. Репликация ДНК полуконсервативна
г. Комплементарное копирование оснований, перенос дезоксинуклеотидов и лигирование ДНК при репликации
д. Ключевые ферменты, участвующие в синтезе ДНК
е. Для репликации необходимо раскручивание спирали
ж. Инициация образования новых цепей ДНК и их рост в репликативных вилках
з. Терминация репликации ДНК и расхождение дочерних спиралей
2. Репликация рнк с образованием днк
а. Репликация геномов ретровирусов
б. Некоторые ДНК-содержащие вирусы используют для репликации обратную транскрипцию
3. Репарация ДНК
а. Репарация путем прямого восстановления исходной структуры
б. Репарация путем замены модифицированных остатков
в. Значение репарации ДНК
4. Рекомбинация ДНК
а. Типы рекомбинации
б. Общая рекомбинация между гомологичными молекулами ДНК
в. Ферменты, участвующие в общей рекомбинации
г. Сайт-специфическая рекомбинация
5. Репликация
Генетическая программа клеточных организмов записана в нуклеотидной последовательности ДНК. Следовательно, для сохранения уникальных свойств организма необходимо точное воспроизведение этой последовательности в каждом последующем поколении. Е. coli, например, должна дуплицировать практически без ошибок полный геном размером 4*106
нуклеотидных пар при образовании каждого последующего поколения; точно так же должны быть скопированы почти 4*109
пар оснований в 23 парах хромосом человека при каждом акте деления клеток.
Одной из чудесных особенностей ДНК является то, что в ней закодирована информация о механизме ее собственного удвоения: одни гены кодируют ферменты, синтезирующие нуклеотидные предшественники ДНК, другие - белки, осуществляющие сборку активированных нуклеотидов в полинуклеотидные цепочки. Есть гены, координирующие процесс репликации с другими клеточными событиями, а также гены, кодирующие белки, которые упаковывают ДНК в хроматин. Еще одним необычным свойством ДНК является то, что она служит матрицей и определяет порядок, в котором нуклеотиды выстраиваются в новые нуклеотидные цепочки. Обладая одинаковым аппаратом синтеза, различные ДНК осуществляют образование только подобных себе реплик.
В генетической программе предусмотрены ферментативный механизм, который исправляет ошибки, иногда происходящие при репликации ДНК, и механизм репарации повреждений, затрагивающих основания или спиральную структуру при облучении рентгеновскими лучами и ультрафиолетовым светом или при воздействии различных химических агентов, а также механизм устранения дефектов, связанных с некоторыми заболеваниями. Генетическая программа обеспечивает создание геномных вариантов и возможность эволюционных изменений. Определенные гены кодируют белки, способствующие обмену цепями, принадлежащими разным молекулам ДНК, и тем самым созданию новых комбинаций генетического материала, передаваемых потомству. Известны белки, вызывающие геномные перестройки путем катализа транслокаций небольших сегментов или даже протяженных участков в пределах одной молекулы ДНК и между молекулами. С одной стороны, рекомбинации и транслокации подобного рода создают основу для эволюционных экспериментов, а с другой - некоторые перестройки могут быть причиной заболеваний. Как это ни странно, оптимальное функционирование некоторых генетических программ действительно зависит от специфических перестроек в ДНК.
Обнародуя свою модель структуры ДНК в 1953 г., Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик писали: "Мы не могли не осознавать, что специфическое спаривание, постулированное нами, подразумевает наличие какого-то механизма копирования генетического материала". И через месяц они углубили эту мысль: "Если известен точный порядок оснований в одной из цепей, то можно записать и порядок оснований в другой, поскольку спаривание оснований специфично. Таким образом, одна цепь является комплементом другой; именно это свойство наводит на мысль, что ДНК может удваивать саму себя".
Уотсон и Крик предположили, что для удвоения ДНК должны произойти разрыв водородных связей, удерживающих вместе спиральный дуплекс, и расхождение цепей. Они также высказали мысль, что каждая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе комплементарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской. Таков механизм точного воспроизведения последовательности нуклеотидных пар в двойной спирали. Уотсон и Крик полагали, что репликация ДНК осуществляется спонтанно, без участия ферментов, но это оказалось неверно. Тем не менее, идея о том, что удвоение ДНК происходит путем последовательного соединения нуклеотидов в соответствии с правилом комплементарности, заданным каждой цепью спирали, разрешила концептуальную проблему точного воспроизведения генов.
С того времени, как было высказано это предположение, матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными данными, полученными как invivo, так и invitro для различных организмов. Согласно модели, репликация всех двухцепочечных ДНК полуконсервативна. Существуют ли в природе альтернативные способы репликации двухцепочечной ДНК - неизвестно. Итак, после одного раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, т.е. консервативной, а другая - синтезированной заново. Если геном представлен одноцепочечной ДНК, то эта единственная цепь служит матрицей для образования комплементарной цепи, с которой она образует дуплекс, а затем на этом дуплексе синтезируются либо дочерние дуплексы, либо одноцепочечные копии одной из матричных цепей.
Начало репликации. Репликация ДНК начинается не в любой случайной точке молекулы, а в специфических местах, называемых точками начала репликации. Процесс копирования продолжается через образование репликативных вилок в одном или обоих направлениях до тех пор, пока ДНК полностью не удвоится. В замкнутых кольцевых дуплексах ДНК новосинтезированные цепи ковалентно соединяются в местах встречи увеличивающихся в размере репликативных вилок или в том месте, где единственная вилка возвращается к точке начала репликации. Дочерние молекулы, как правило, расходятся еще до начала нового раунда репликации. Такие различающиеся по размеру геномы, как геном вируса SV40, бактериофага X и E. coli, воспроизводятся в результате одного инициирующего события, происходящего в определенной точке.
У про - и эукариот можно встретить различные вариации на эту тему. Так, каждая из цепей родительской спирали митохондриальной ДНК животных и ДНК плазмиды ColE1 имеет свою точку начала репликации. Синтез комплементарной цепи некоторых небольших одноцепочечных фаговых геномов начинается вблизи одной специфической последовательности, а репликация полученного дуплекса может инициироваться совсем в другой точке. Репликация линейных дуплексных ДНК также инициируется в особых сайтах. Например, ДНК бактериофага Т7 реплицируется в двух противоположных направлениях к разным концам молекулы, начиная от одной точки, а каждая из двух цепей ДНК аденовируса человека реплицируется последовательно всегда от З'-конца.
Для геномов эукариотических клеток обычно характерно наличие множественных точек начала репликации, разбросанных по хромосоме на расстоянии 20 т.п. н. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор, пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких, независимо инициированных новосинтезированных цепей.
Скорость репликации генома. Скорость репликации генома регулируется в основном частотой инициирующих событий. Так, у Е. coli скорость копирования в каждой репликативной вилке постоянна и равна примерно 1500 п. н. в секунду; следовательно, полный геном длиной 4*106
пар реплицируется примерно за 40 мин. Если хромосома реплицируется быстрее, это значит, что увеличивается частота актов инициации в той же самой точке начала репликации при прежней скорости копирования. Клетки Е. coli делятся каждые 20 мин; это означает, что репликация ДНК инициируется в хромосомах, еще не закончивших предыдущий раунд репликации. Скорость движения репликативной вилки в эукариотических клетках значительно меньше, но завершение репликации хромосомы в разумное время обеспечивается одновременной инициацией во множестве точек. Итак, скорость репликации хромосом контролируется числом и расположением точек начала репликации. Например, в ранних эмбрионах дрозофилы репликация хромосомы осуществляется каждые 3 мин благодаря почти одновременной инициации событий в точках, отстоящих друг от друга на 7000-8000 п. н. В культуре клеток Drosophila наблюдается значительно более медленная скорость дупликации хромосомы, поскольку репликация начинается в гораздо меньшем числе точек, находящихся друг от друга на расстоянии 40000 п. н. Следовательно, при фиксированной скорости роста цепи множественная инициация обеспечивает большую скорость процесса и уменьшает время, необходимое для дупликации протяженных участков хромосом.
Структура точек начала репликации. Фрагменты ДНК, несущие точку начала репликации, выделены из Е. coli и некоторых колифагов и плазмид, а также из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, которую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы очень мало, однако можно сказать, что, по-видимому, они в разных случаях различны.
После начала репликации репликативные вилки движутся в одном или обоих направлениях вдоль молекулы ДНК. Чем дальше продвинулась вилка, тем длиннее новосинтезированный сегмент ДНК. Прежде чем обсуждать данные о механизмах инициации репликативной вилки и ее движения, полученные с помощью модельных систем репликации у прокариот, рассмотрим основную реакцию, протекающую в репликативной вилке в процессе копирования двухцепочечной ДНК.
Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к З'-гидроксильному концу уже имеющейся цепи. Следовательно, они синтезируются в направлении 5'->3'вдоль матричной цепи, ориентированной в противоположном, 3'->5', направлении. Синтез цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно, а другой - импульсами. Такой механизм репликации называется полунепрерывным. Ведущая цепь растет от 5' - к 3'-концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте инициации. Рост отстающей цепи также идет от 5' - к 3'-концу, но в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов инициации, в результате чего образуется множество коротких цепей. Эти цепи, называемые фрагментами Оказаки в честь открывшего их ученого, имеют размеры 1000-2000 нуклеотидов у прокариот и 100-200 в реплицирующейся ДНК эукариот. По мере движения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи.
Механизмы инициации репликации в точке начала репликации и при образовании фрагментов Оказаки в отстающей цепи в принципе аналогичны, хотя имеются некоторые тонкие различия. В обоих случаях происходит образование коротких РНК-затравок, комплементарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется новая цепь ДНК. В дальнейшем короткие вставки РНК замещаются сегментами ДНК, которые затем объединяются с образованием непрерывной отстающей цепи.
Нуклеотидная последовательность матричной цепи задает порядок расположения нуклеотидов в новосинтезируемых цепях ДНК. Несмотря на то что правило комплементарности обеспечивает большую надежность процесса копирования, последний небезошибочен. Из-за случайных флуктуации в структуре присоединяемых оснований и оснований, входящих в состав матричной цепи, могут происходить ошибочное спаривание и включение неправильных нуклеотидов. При включении неправильного нуклеотида дальнейший рост цепи обычно останавливается. Ферменты, катализирующие присоединение нуклеотидов, обладают эффективной системой коррекции - они удаляют включенный, но неспаренный нуклеотид почти сразу после присоединения его к концу растущей цепи. В общем виде реакцию присоединения 5'-дезоксинуклеотидной группы к З'-ОН-группе концевого нуклеотида праймерной цепи можно представить следующим образом:
„ + dNTP <=> m
1
+ PP,
где dNMP-любой из четырех обычных нуклеотидов. За один акт репликации праймерная цепь удлиняется на один остаток, при этом одновременно происходит удаление пирофосфата. Реакция присоединения нуклеотида обратима, но в целом она смещена в сторону синтеза, поскольку неорганический фосфат в клетках быстро разрушается. Ферменты, катализирующие праймер-зависимую, детерминируемую ДНК-матрицей реакцию присоединения дезоксинуклеотидов, называются ДНК-полимеразами. Многие ДНК-полимеразы выделены и охарактеризованы.
Фрагменты Оказаки, образующиеся при импульсном копировании цепи ДНК, должны впоследствии объединиться в непрерывную отстающую цепь. Эта реакция осуществляется ДНК-лигазами - ферментами, катализирующими ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе; ДНК-лигазы играют ключевую роль не только в репликации, но и в репарации повреждений и рекомбинации ДНК.
Многие известные теперь детали процесса репликации ДНК удалось установить благодаря исследованию поведения и активности ферментов, обеспечивающих работу аппарата репликации. Наиболее полно изучен механизм репликации бактериальной ДНК, особенно ДНК Е. coli и бактериофагов, которые в ней размножаются. Довольно хорошо известны и ферменты репликации дрожжей, Drosophila, клеток и вирусов млекопитающих. Здесь мы обсудим механизм действия ДНК-полимераз и ДНК-лигаз, поскольку при синтезе длинных цепей ДНК эти два фермента работают согласованно.
ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках. Более того, многие вирусы бактерий и животных индуцируют образование вирус-специфических ДНК-полимераз или белков, способствующих эффективному участию ДНК-полимераз клеток-хозяев в репликации вирусной ДНК. Некоторые прокариотические и эукариотические ДНК-полимеразы выделены в чистом виде, а их физические и ферментативные свойства охарактеризованы. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков.
Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I E. coli. Она представляет собой одиночный полипсптид с мультифункциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Pol I катализирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к 3'-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве дезоксинуклеотидного акцептора и матрица, детерминирующая присоединение нужного нук-леотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Pol I катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с З'-конца цепи. Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца дуплексной ДНК в направлении к 3'-концу. Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи PolI. Если invitro обработать Pol I трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент сохраняет ДНК-полимеразную и 3'-5'-экзонуклеазную активности; малый, N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонуклеазной активностью.
PolI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК E. coli.3'-5'-экзонуклеаз-ная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем PolI, то при репликации генома часто происходят мутации - замены оснований.
Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-ко-нец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей цепи. PolI удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку PolI способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва. этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется invitro для синтеза радиоактивно меченной ДНК.
У Е. coli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. PolII присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем PolI, и не обладает 5'-3'-эк-зонуклеазной активностью. Следовательно, PolII может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль PolII в репликации и сохранении хромосомной ДНК E. coli до настоящего момента неясна.
PolIII-холофермент - это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится только 10-20 копий PolIII-холофермента, и тем не менее он является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Но поскольку PolIII-xo-лофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие PolI, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии Pol III, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.
Обнаружены изменения в полипептидной цепи основного фермента Pol III, известны аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, а-субъединица обладает полимеразной активностью, а £-субъединица - 3'-5'-экзонуклеазной. Однако комплекс а - и £-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, 9-субъединицы пока неясна.
Помимо субъединиц, составляющих PolIII-кор, PolIII-холофермент содержит еще семь субъединиц: т, у, в, б, б', х и г|). Перечисленные полипептиды также существуют во множестве копий, так что в результате мол. масса комплекса составляет примерно 103
кДа. Роль в-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования; точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что
PolIII-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой - прерывистой отстающей.
PolIII-холофермент катализирует те же реакции синтеза, что и PolI, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, PolIII-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. PolIII-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках, инициирующие образование праймерных РНК, обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.
ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. coli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3'-5'-экзо-нуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у некоторых ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонук-леазную реакцию коррекции ошибок, но не способна катализировать 5'-3'-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих цепей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой.
В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-полимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у соответствующих ферментов прокариот. Из клеток млекопитающих выделены четыре ДНК-полимеразы: а, в и б содержатся в ядрах, а у - в митохондриях. ДНК-полимераза а участвует в репликации хромосомной ДНК. Ее полимеразная активность связана с большим полипептидом, но она существует и, возможно, функционирует как муль-тисубъединичный белок, аналогично PolIII-холоферменту E. coli. в-Полимераза - это одиночный полипептид, функцией которого является заполнение пробелов при репарации повреждений ДНК. Митохондриальная полимераза у, состоящая из четырех идентичных полипептидов, ответственна за репликацию митохондриального генома. б-Полимераза похожа на полимеразу а по своим молекулярным и синтетическим свойствам и также участвует в репликации хромосомной ДНК. Поскольку а-, в - и у-ДНК-полимеразы млекопитающих лишены 3'-5' - и 5'-3'-экзонуклеазных активностей, присущих ферментам Е. coli, остается неясно, как в процессе репликации ДНК у этих организмов удаляются случайно включенные ошибочные нуклеотиды и РНК-затравки на концах фрагментов Оказаки.
Некоторые вирусы животных индуцируют синтез особых полимераз для репликации своих геномов. Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки, "запускающие" инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуцируют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию.
ДНК-лигазы. ДНК-лигазы необходимы для соединения цепей ДНК при репликации, репарации и рекомбинации. Все известные лигазы способны образовывать фосфодиэфрные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрывов ДНК. ДНК-лигаза, индуцируемая в E. coli после заражения клетки фагом Т4, уникальна по своей способности соединять двухцепочечные фрагменты ДНК по концам разрыва. Физиологическая роль этой реакции неизвестна, но практическое ее значение в манипуляциях с рекомбинантной ДНК неоценимо.
ДНК-лигазы некоторых бактерий, бактериофагов и млекопитающих выделены и их структура и механизм каталитической активности установлены. ДНК-лигазы Е. coli, T4 и Т7-это одиночные полипептидные цепи, либо АТР, либо его производного - никотинамид-адениндинуклеотида. Реакция протекает в несколько этапов:
1) аденилильная единица NAD или АТР переносится на £-аминогруппу лизинового остатка лигазы с одновременным высвобождением никотинамидмононуклеотида или неорганического фосфата соответственно;
2) аденилильная группа переносится от белка на 5'-фосфорильную группу концевого остатка цепи ДНК с образованием пирофосфорильного производного, аденилил-ДНК;
3) аденилильная группа, связанная с 5'-фосфорильной группой, замещается 3'-гидроксильной группой прилегающего конца ДНК. В результате этих реакций происходит образование фосфодиэфирных связей в цепи ДНК за счет энергии гидролиза пирофосфорильной связи NAD или АТР. Для образования фосфодиэфирной связи во всех случаях, кроме лигазы фага Т4, должно произойти соединение нуклеотида, содержащего акцепторную 3'-гид-роксильную группу, с соседним нуклеотидом, несущим активированную 5'-фосфорильную группу. ДНК-лигазы Е. coli и фага Т4 могут соединять концы двух разных дуплексных фрагментов или разорванные концы цепей линейной или кольцевой ДНК. Таким образом, с помощью ДНК-лигаз могут образовываться и линейные, и кольцевые дуплексные молекулы ДНК.
Для осуществления комплементарного копирования цепей двухцепочечная ДНК должна постепенно раскручиваться. Раскручивание, или расплетание, спирали происходит только в локальном участке репликативной вилки. Расплетание - это не спонтанный процесс, в нем участвуют белки двух типов. Одни из них, называемые ДНК-гелика-зами, используют для разделения цепей энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР до ADP. Геликазы часто функционируют в составе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетенных цепей. Вообще говоря, для расплетания достаточно одного геликазного белка, но для того, чтобы максимизировать скорость раскручивания, несколько геликаз могут действовать совместно. Белки второго типа, дестабилизирующие спираль, - это белки, связывающиеся с одноцепочечными участками и тем самым стабилизирующие расплетенный дуплекс. Итак, геликазы вызывают локальное раскручивание двойной спирали, а другие специфические белки тотчас связываются с образовавшимися одноцепочечными участками, обеспечивая условия для комплементарного спаривания.
При репликации хроматиновой ДНК эукариотических организмов возникают дополнительные сложности. Чтобы расплести ДНК в составе хроматина, необходимо разрушить сильно конденсированный комплекс гистонов и ДНК, а по завершении репликации вновь упаковать две дочерние спирали в сложные хроматиновые структуры. Каким образом раскручиваются эукариотические хромосомы при подготовке к репликации? Об этом известно очень мало. Развернутые, предсуществующие и новые нуклеосомы должны ассоциировать с синтезированной дуплексной ДНК. Чтобы предотвратить образование слишком протяженных участков несвязанной ДНК в период репликации, сборка хроматина должна происходить параллельно образованию дуплексной ДНК. Связываются ли родительские гистоновые октамеры с одной или обеими дочерними спиралями - пока неизвестно.
Топологические проблемы раскручивания и репликации ДНК. Процесс раскручивания двойной спирали в репликативной вилке порождает механические и топологические проблемы. В принципе расплетание линейной дуплексной ДНК может происходить благодаря вращению родительской спирали вокруг собственной оси. Однако вращение очень длинных цепей ДНК вокруг длинных же осей во внутриклеточном пространстве механически затруднено. При репликации замкнутых кольцевых ДНК расплетание цепей в вилке создает дополнительные проблемы. По мере раскручивания цепей степень отрицательной сверхспиральности сегментов, находящихся перед вилкой репликации, постепенно уменьшается и в них возникает положительная сверхспирализация. Дальнейшее перемещение вилки вдоль кольца затрудняется и в конце концов блокируется. Это блокирование снимается путем внесения одноцепочечного разрыва. Тем самым образуется "шарнир", который дает возможность нереплицированному дуплексу, находящемуся перед вилкой, вращаться вместе с ней. Такие разрывы вносятся в ДНК с помощью ферментов, имеющих общее название ДНК-топоизомеразы.
ДНК-топоизомеразы. Эти ферменты изменяют степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Они не только приводят к образованию шарнира, который создает условия для непрерывного движения репликативной вилки, но и обеспечивают разделение или образование катенанов - сцепленных кольцевых ДНК, а также устранение узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Топоизомеразы являются также неотъемлемыми участниками некоторых рекомбинационных процессов.
В различных организмах идентифицированы топоизомеразы двух основных типов. Одни ферменты, называемые топоизомеразами типа I, уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не требует энергии АТР, поскольку энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в молекуле фермента выступает то в роли акцептора, то в роли донора фосфорильного конца разрезанной цепи. Одиночная цепь спонтанно проходит через разрез. Отмечены два интересных, но, возможно, не связанных друг с другом различия между топоизомеразами типа I про - и эукариот:
1) топо-изомеразы типа I прокариот взаимодействуют с 5'-фосфорильным концом разорванной цепи, а эу-кариот - с 3'-фосфорильным концом;
2) топоизомеразы прокариот устраняют только отрицательные сверхвитки, а эукариотические - как отрицательные, так и положительные.
Топоизомеразы типа II устраняют как отрицательные, так и положительные сверхвитки. В отличие от ферментов типа I топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплементарные цепи, пропускают двухцепочечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. Топоизомеразы типа II тоже используют тирозиновые остатки для связывания 5'-конца каждой разорванной цепи в то время, когда другой дуплекс проходит через место разрыва.
В результате внесения двухцепочечного разрыва и прохождения через него другого дуплекса за один акт снимаются два отрицательных или положительных сверхвитка. В некоторых случаях дуплексом, проходящим через место разрыва, оказывается другая замкнутая молекула ДНК; это приводит к разделению сцепленных кольцевых ДНК или, напротив, к образованию таких сцепленных комплексов. Этот механизм может использоваться и для распутывания или запутывания клубков, а также для раскручивания или конденсации крупных дуплексных ДНК.
Топоизомеразы типов I и II снимают сверхвитки, образующиеся при репликации кольцевой ДНК.
Однако существует особая топоизомераза II, называемая гиразой и обнаруженная пока только у бактерий, которая индуцирует образование отрицательных сверхвитков в релаксированных кольцевых ДНК. Для этого гираза делает двухцепочечные надрезы и затем особым способом воссоединяет концы. Итак, гираза снимает положительные сверхвитки и вносит отрицательные в релаксированную ДНК. Сбалансированное действие топоизомеразы I и гиразы - по крайней мере у бактерий - по-видимому, регулирует степень сверхспиральности ДНК и таким образом влияет на скорость движения репликативной вилки.
Механизм, с помощью которого гираза катализирует образование отрицательных сверхвитков в кольцевой или другой ДНК с топологическими ограничениями, до конца не установлен. Гираза Е. coli представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц двух типов, при этом а-субъединицы содержат сайты ковалентного связывания концов молекулы ДНК. Гираза катализирует образование отрицательных сверхвитков, создавая сначала положительные сверхвитки в определенных областях ДНК, связанных с ферментом.
Ориентация двух спиральных сегментов в этих областях меняется на противоположную при протягивании одного сегмента через "ворота", образовавшиеся в результате двухцепочечного разрыва в другом.
В конце концов образуются два сверхвитка за один каталитический цикл. Для реализации всех этих процессов необходима энергия гидролиза АТР, поскольку релаксированная кольцевая ДНК должна быть переведена на более высокий энергетический уровень, характерный для сверхспиральной конформации.
Инициация образования новых цепей ДНК. В отличие от РНК, синтез которой инициируется РНК-репликазами и РНК-полимеразами, для инициации синтеза ДНК требуется затравка. Сначала синтезируются короткие РНК-праймеры, которые затем наращиваются в виде цепей ДНК. При переводе кольцевой одно-цепочечной ДНК фага М13 в двухцепочечную репликативную форму для синтеза коротких сегментов РНК в точке начала репликации используется РНК-полимераза-холофермент. При репликации других одноцепочечных кольцевых фаговых ДНК РНК-праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой, называемой праймазой. У другого фага с одноцепочечной кольцевой ДНК мультиферментный комплекс, содержащий от 15 до 20 полипептидных цепей, активирует матричную цепь, в результате чего праймаза синтезирует РНК-затравку. Праймосомопраймазный способ инициации применяется и для инициации синтеза ведущей цепи в точке начала репликации у Е. coli, а также при образовании фрагментов Оказаки при синтезе отстающей цепи.
По-видимому, синтез цепей ДНК инициируется сходным образом у про - и эукариот, в случае плазмид и вирусов. Различия могут касаться типов полимераз, синтезирующих РНК-затравки, вспомогательных белков, обеспечивающих инициацию РНК-транскриптов, и либо нуклеотидных последовательностей perse, либо структурных особенностей, определяющих положение точки начала транскрипции. Длина РНК-праймеров варьирует в зависимости от особенностей инициации. У бактериофага фХ174 и Е. coli праймаза катализирует синтез РНК-праймеров длиной от двух до пяти нуклеотидов, а при репликации ДНК эукариот праймерные РНК приблизительно в два раза длиннее. У бактериофагов М13 и G4 синтез РНК-затравок катализируют РНК-полимераза и G4-праймаза соответственно; длина этих затравок колеблется от 20 до 30 нуклеотидов, и они комплементарны сегментам фаговых ДНК, образующим петли. Точная природа сигналов, определяющих сайты синтеза праймерной РНК для инициации репликации или для синтеза отстающей цепи, неизвестна.
Репликация плазмидной ДНК ColE1 также начинается с транскрипции РНК. Однако в этом случае синтез праймерной РНК инициируется РНК-полимеразой в сайте, отстоящем на 555 пар оснований от точки начала репликации плазмидной ДНК. Транскрипция проходит точку начала репликации, при этом синтезируется цепь РНК длиной 500-600 нуклеотидов. Затем РНКаза-Н расщепляет большую часть цепи РНК. Остающийся 3'-конец РНК служит затравкой при синтезе цепи ДНК с помощью PolI-полимеразы. Эта цепь становится ведущей при репликации всей плазмидной ДНК.
У аденовирусов человека синтез новых цепей ДНК инициируется неким белком, а не РНК. Аденовирус типа 2 содержит белок с мол. массой 55 кДа, ковалентно связанный с 5'-фос-фатом каждой цепи ДНК. Первый этап инициации синтеза новых цепей состоит в том, что кодируемый вирусом белок мол. массой 80 кДа связывается с дезоксинуклеозидтрифосфатом, соответствующим первому дезоксинуклеотидному остатку в ДНК, с образованием комплекса белок-dCMP. 3'-гидроксильная группа связанного с белком дезоксицитидинового остатка служит праймером для удлинения цепей ДНК с использованием комплементарной цепи ДНК в качестве матрицы. В конечном счете вирусный 80 кДа-белок отщепляется и с новосинтезированной вирусной ДНК остается связанным только терминальный белок мол. массой 55 кДа. Аналогичный механизм инициации синтеза ДНК используется и другими аденовирусами и некоторыми бактериофагами.
Одновременная репликация обеих цепей в репликативной вилке. Изучение механизма репликации фаговой ДНК с использованием очищенных ферментов из Е. coli позволило построить усовершенствованную модель полуконсервативной прерывистой репликации ДНК в репликативной вилке. Для расплетания спирали при образовании вилки необходимо, чтобы в ДНК образовались отрицательные сверхвитки. Расплетание осуществляется АТР-зависимой геликазой и облегчается в присутствии белка, связывающегося с одно-цепочечной ДНК. После инициации репликации
PolIII-холофермент удлиняет лидирующую цепь ДНК до размеров, равных длине хромосомы, путем последовательного присоединения к 3'-гидроксиль-ному концу дезоксинуклеотидильных единиц.
Синтез отстающей цепи инициируется праймо-сомо-праймазным комплексом. Праймо-сома, обладающая геликазной активностью, расплетает спираль и, возможно, способствует формированию подходящих структур, позволяющих ассоциированной праймазе синтезировать праймер. Праймосомо-праймазный комплекс движется в том же направлении, что и вилка, останавливаясь только для того, чтобы расплести дуплекс и синтезировать РНК-праймеры. Эти короткие фрагменты РНК достраиваются затем PolIII-холоферментом путем добавления дезоксинуклеотидтрифосфатов с образованием фрагментов Оказаки длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. Удаление сегментов РНК с 5'-конца каждого фрагмента Оказаки и заполнение пробелов между ними катализируется PolI, способной удлинять цепи и осуществлять ник-трансляцию. Когда растущий 3'-гидроксильный конец каждого фрагмента Оказаки доходит до 5'-дезоксинуклео-тидного конца соседнего фрагмента, вступает в действие ДНК-лигаза и образуется непрерывная отстающая цепь. Более сложная, но все же гипотетическая модель движения репликативной вилки предполагает формирование реплисомы - мультиферментного комплекса более высокого уровня организации, состоящего из функционального праймосомо-праймазного комплекса, геликазы, PolIII-холофермента и, возможно, гиразы. Такой комплекс может обеспечивать удлинение лидирующей цепи и одновременно инициацию праймерной РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отстающей цепи. Две реплисомы, работающие согласованно в двух вилках репликации, которые движутся в противоположных направлениях вдоль кольцевой хромосомы, сделали бы эту модель еще более изящной.
ДНК. Субстратной матрицей в этом случае является двухцепочечная кольцевая ДНК, которая была реплицирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму. Для того чтобы образовалась линейная ДНК потомства, двухцепочечные кольца надрезаются и асимметрично реплицируются, как это происходит в случае ДНК фагов М13 и фХ174. Однако отделяющиеся одиночные цепи превращаются в двухцепочечные структуры. Сначала во множестве сайтов вдоль одиночной цепи праймаза синтезирует короткие сегменты РНК. Затем эти сегменты достраиваются PolIII-холоферментом, пробелы заполняются, РНК удаляется с помощью PolI и наконец короткие фрагменты ДНК соединяются ДНК-лигазой. При упаковке ДНК в фаговые частицы в специальных участках, называемых cos-сайтами и отстоящих друг от друга на длину вирусного генома, образуются надрезы. В результате длинные дуплексы многократно повторенной ДНК фага X расчленяются на фрагменты, соответствующие по размерам зрелой ДНК, обнаруживаемой в вирионах.
Поочередная репликация цепей. Репликация ДНК аденовируса происходит без синтеза отстающей цепи и поэтому без образования множественных сайтов инициации и фрагментов Оказаки. Вместо этого цепи линейного дуплексного генома реплицируются попеременно. Сначала через образование белкового праймера происходит инициация одной цепи, которая непрерывно удлиняется вплоть до завершения репликации. Вытесненная новосинтезированной цепью, вторая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе таким же способом следующего дуплекса. С какого конца родительского дуплекса начнется процесс, по-видимому, неважно. Репликация ДНК аденовируса необычна в двух отношениях:
1) использование белка для запуска синтеза цепи ДНК с конца линейного дуплекса;
2) отсутствие прерывистой репликации, опосредуемой РНК-транскриптами.
Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает завершение репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепей вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3'-гидрокси - и 5'-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо - при двунаправленной репликации - в середине кольца. Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом обычно они оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II.
Терминация и завершение репликации в линейных ДНК. За исключением репликации аденовирусной ДНК, где синтез новых цепей ДНК инициируется белковым праймером и матричная цепь копируется полностью, во всех других случаях для репликации необходим РНК-праймер, что создает особые проблемы при завершении репликации линейной дуплексной ДНК. Дело в том, что после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5'-конце. Поскольку никаких способов удлинения 5'-концов цепей ДНК не существует, необходимы какие-то иные методы завершения репликации.
Были предложены два способа, с помощью которых процесс репликации мог бы завершаться. Один из них предполагает, что существуют цепи ДНК с прямыми повторами на концах. После репликации два комплементарных конца обоих незавершенных дуплексов могут спариться и образовать линейные конкатемеры с одноцепочечными разрывами. Остающиеся пробелы могут быть заполнены путем удлинения цепей в направлении 3'->5' с последующим соединением их ДНК-лигазой либо путем прямого соединения стыкующихся концов с помощью ДНК-лигазы с образованием конкатемеров. После надрезания конкатемера специфической эндонуклеазой образуются выступающие 5'-концы, и ДНК-полимераза может наращивать более короткие цепи с 3'-конца. Другой способ предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК коротких инвертированных повторов, благодаря которым образуются небольшие петли.3'-конец петли служит праймером для копирования нереплицированного участка. Благодаря специфическому разрыву в начале инвертированного повтора получается структура, которую можно достроить с 3-конца до восстановления исходной двухцепочечной концевой последовательности.
Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом - теломеры - реплицируются с помощью особого механизма, отличного от представленных выше. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное, весьма необычное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3' - и 5'-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много коротких тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Вопрос о том, как подобная структурная организация может способствовать репликации концов дуплексных участков, выясняется. Если учесть сходство структурных особенностей конечных областей хромосом, то можно предположить, что механизм репликации всех эукариотических хромосом одинаков.
Геном ретровирусов представлен единственной молекулой одноцепочечной РНК. После проникновения РНК в клетку хозяина вирусный геном подвергается обратной транскрипции, при этом сначала образуется дуплекс РНК-ДНК, а затем двухцепочечная ДНК. Эти этапы предшествуют экспрессии вирусных генов на уровне белков и образованию РНК-геномов.
Фермент, катализирующий комплементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной транскриптазой. Он содержится в ретровирусных частицах и активируется после попадания вируса в клетку и разрушения его липидно-гликопротеиновой оболочки. Вполне вероятно, что обратной транскрипции способствуют какие-то вспомогательные белки, находящиеся внутри вирионов, поскольку в присутствии последних ферментативная реакция протекает гораздо эффективнее и быстрее, чем в присутствии очищенного фермента. Появляется все больше данных о том, что обратная транскрипция происходит в самых разных эукариотических клетках, а обратная транскриптаза играет важную роль в процессах перестройки генома
Обратные транскриптазы ретровирусов по существу являются ДНК-полимеразами, и invitro могут использовать в качестве матрицы ДНК. Однако гораздо эффективнее они работают, если матрицей является РНК. Как и все ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы не способны инициировать синтез новых цепей ДНК. Но если синтез уже инициирован с помощью праймерной РНК или 3'-концево-го участка ДНК, то фермент эффективно осуществляет синтез, используя цепь ДНК как матрицу.
Ретровирусы - это диплоидные организмы, поскольку каждый вирион содержит две идентичные цепи РНК размером от 8000 до 10000 нуклеотидов. Цепи соединены вблизи своих 5'-концов, однако природа этого нековалентного взаимодействия неизвестна. Области 5' - и 3'-концов обеих цепей модифицированы, как и у всех эукариотических мРНК. Рассматривая механизм обратной транскрипции, необходимо отметить наличие пяти структурных элементов у вирусной РНК:
1) прямые повторы на 5' - и 3'-концах РНК;
2) последовательность из 80-120 нуклеотидов, соседствующая с 5'-концевым повтором;
3) последовательность из 170-1200 нуклеотидов, соседствующая с 3'-конце-вым повтором;
4) последовательность из 15-20 нуклеотидов, в пределах которой клеточная тРНК спаривается с ретровирусной РНК, что создает праймер для синтеза первой цепи ДНК;
5) сегмент Ри, находящийся непосредственно перед повтором U3 и являющийся сайтом для праймирования второй цепи ДНК; такой сегмент одинаков у РНК всех ретровирусов определенного типа.
Известны три продукта, образующиеся в результате обратной транскрипции: форма А - линейный дуплекс ДНК с последовательностью U3RU5, имеющийся на обоих концах дуплекса; два кольцевых дуплекса ДНК, производных формы А; форма В с LTR-повторами на обоих концах и форма С только с одним LTR. Объяснить образование структур А, В и С при обратной транскрипции вирусной ДНК весьма непросто. Процесс начинается с наращивания тРНК-праймера на матрицах U5 и R в направлении 3' - >5'. Затем РНКаза Н, специфичная к РНК в составе гибридного РНК-ДНК-дуплекса, расщепляет сегмент РНК этого дуплекса. Поскольку на 3'-конце РНК имеется повтор R, новосинтезированная короткая цепь ДНК "перепрыгивает" на этот конец молекулы мРНК и спаривается там с комплементарным ей участком. Далее происходит удлинение цепи ДНК с использованием в качестве матрицы остальной части мРНК. К моменту завершения синтеза первой цепи ДНК большая часть вирусной ДНК разрушается РНКазой Н. Затем в предполагаемом сайте связывания праймера вблизи повтора U3 инициируется синтез второй цепи ДНК с использованием новосинтезированной первой цепи в качестве матрицы. Праймером для синтеза второй цепи может быть РНК, однако как идет синтез второй цепи - непрерывно или прерывисто - неизвестно. После репликации тРНК-связывающей последовательности на 5'-конце первой цепи ДНК тРНК, по-видимому, удаляется. Затем новосинтезированная вторая цепь ДНК спаривается с тРНК-связывающей последовательностью первой цепи. После удлинения 3'-концов каждой цепи завершается образование дуплекса ДНК. Обратите внимание, что на каждом конце ДНК-дуплекса имеется прямой повтор последовательности U3RU5 - LTR. Кольцевые ДНК, по-видимому, образуются либо путем лигирования концов линейной ДНК, либо путем гомологичной рекомбинации между сегментами LTR. Удивительно, что такая сложная последовательность реакций протекает без явного участия ферментов репликации клетки-хозяина. Репликация двухцепочечной формы ретровирусной ДНК не начинается до тех пор, пока она не встроится в клеточную ДНК. Субстратом для такого интеграционного события является продукт обратной транскрипции - линейная дуплексная ДНК. Механизм рекомбинационного встраивания пока полностью не установлен. В результате интеграции образуется структура. При интеграции на обоих концах интегрированной вирусной ДНК утрачивается по нескольку нуклеотидов в пределах LTR-последовательностей и происходит дупликация 3-10 нуклеотидов клеточной ДНК. После интеграции ретровирусная ДНК реплицируется как часть клеточной ДНК. РНК дочерних вирионов образуется в результате транскрипции интегрированных копий вирусной ДНК. Инициация синтеза РНК происходит в крайних левых точках стыковки U3R, а терминация-в крайних правых точках стыковки RU5.
Геном вируса гепатита В человека представлен кольцевой двухцепочечной ДНК с пробелами. Если вирус находится внутри клетки, то пробелы заполняются вирионной ДНК-полимеразой. Такая почти полноразмерная цепь ДНК играет роль матрицы, на которой синтезируется РНК. Длина этой РНК равна длине генома вируса, и она играет роль мРНК в процессе экспрессии вирусных белков и роль матрицы при обратной транскрипции с образованием дочерней вирусной ДНК. Аналогичный механизм реализуется и при репликации вируса мозаики цветной капусты и других вирусов растений.
ДНК - это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплементарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но и процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации. Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двухцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.
Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации. Если не принимать никаких мер, то это приведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки цитозина и аденина могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием соответственно остатков урацила и гипоксантина; частота таких событий составляет примерно 100 на геном в сутки. Если подобные нарушения в ДНК не будут устранены до следующего раунда репликации, то они могут послужить источником мутаций.
Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. К таким веществам относятся алкилирующие агенты, которые модифицируют предпочтительно гуаниновые остатки; соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительными могут быть и физические воздействия. Поглощение тиминовым или цитозиновым основанием ультрафиолетового света может приводить к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; под действием ионизирующей радиации, например космических лучей, могут образовываться высоко реакционноспособные свободные радикалы, оказывающие на ДНК самые разнообразные воздействия; при облучении рентгеновскими лучами в медицинских целях в ДНК могут возникать одно - и двухцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия на ДНК свободных радикалов.
Как же ДНК противостоит таким разрушительным воздействиям? Благодаря какому механизму восстанавливается нормальная структура нуклеотидов и их последовательность прежде, чем эффект воздействия закрепится и проявится в виде мутации?
Известны два основных типа репарационных процессов:
1) непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;
2) удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ре-синтез этого участка путем репликации.
Под действием алкилирующих агентов, например N-метил-гТГ-нитрозомочевины или Ч^гЧ-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образуются О6
-метил - или О6
-алкилзамещенные гуаниновые остатки. Такие модифицированные остатки гуанина могут деалкилироваться при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и млекопитающих. О6
-метилгуанин-ДНК-алкилтрансфераза катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Содержание алкилтрансферазы в клетках Е. coli увеличивается в присутствии О6
-алкилгуанина, но в клетках млекопитающих аналогичной индуцибельности не наблюдается.
При облучении ДНК ультрафиолетовым светом в ней образуются циклобутановые димеры между соседними пиримидиновыми основаниями. Такие соединения блокируют репликацию ДНК, и для сохранения жизнеспособности клетки их необходимо удалить. Один из способов удаления пиримидиновых димеров состоит в ферментативном превращении их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Такие фотореактивирующие ферменты имеются у бактерий и низших эукариотических организмов, но в клетках млекопитающих они не обнаружены. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и, используя энергию поглощенного им света, разрушает димер без разрыва цепей ДНК.
Замена модифицированного нуклеотида обычно происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Во-вторых, экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь. В-третьих, удаленный участок синтезируется заново с 3-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи. В-четвертых, концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи.
Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация, выщепляются ферментами, называемыми АР-эндонуклеазами. В клетках про - и эукари - от имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз, часто по нескольку разных типов. Некоторые АР-эндонуклеазы надрезают цепь с 3'-стороны АР-сайта, а другие расщепляют диэфирную связь с 3'-сто-роны; в любом случае образуются 3'-гидроксильный и 5'-фосфорильный концы. Разрыв фосфодиэфирной связи по одну или другую сторону от места нарушения позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны сайта расщепления и затем ресинтезировать удаленную последовательность.
В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют специфические N-гликозилазы - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между модифицированными основаниями и дезоксирибозой. N-гликозилазы используются и при коррекции нарушений, состоящих в спонтанном дезамини-ровании цитозина или аденина и превращении их соответственно в урацил или гипоксантин. Ферменты урацил-гликозилаза и гипоксантин-гликозилаза выщепляют из ДНК соответственно урацил и гипоксантин, оставляя пробелы в месте выщепления. И вновь с помощью механизма выщепления-ресинтеза восстанавливается исходная последовательность поврежденной цепи.
Урацил-гликозилаза играет очень важную антимутагенную роль и при исправлении ошибок, происходящих при использовании во время репликации dUTP вместо dTTP. Поскольку спаривание dUMP с матрицей происходит почти так же хорошо, как и dTMP, Pol III его не распознает, и если dUMP не подвергается специфическому выщеплению, то при последующем раунде репликации в новую цепь может включиться dGMP. Таким образом, г-гликозилаза защищает клетки от возможных мутагенных последствий включения в цепь ДНК dUMP.
Репарация тиминовых димеров может происходить и в темноте одним из следующих двух способов. В клетках Е. coli синтезируются три полипептида, кодируемые генами uvrA, uvrB и uvrC, которые образуют ферментный комплекс uvrЛВC-эндонуклеазу. Этот фермент разрезает цепь ДНК, содержащую пиримидиновый димер, на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5'-стороны и четырех или пяти связей с 3'-стороны пиримидинового димера. Удаление поврежденного участка, по-видимому, катализируется геликазой, кодируемой еще одним геном, uvrD. В результате удаляется тиминовый димер и еще примерно 12 окружающих его нуклеотидов. Образовавшийся пробел заполняется с помощью PolI, а ДНК-лигаза завершает репарацию, соединяя два соседних основания цепи. Некоторые организмы используют для репарации повреждений, возникающих при образовании пиримидиновых димеров, другой механизм. Репарация осуществляется при участии пиримидиновый димер-г-гликозилазы, которая создает апиримидиновый сайт. Гликозидная связь между одним из тиминов и дезоксирибозой разрезается так, что тиминовый димер остается на 5'-конце разорванной цепи, а 3'-ОН-группа - на дезоксирибозе. Образовавшийся 3'-АР-конец отщепляется с помощью 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а затем путем ник-трансляции и лигирования удаляется нуклеотид вместе с прилежащим тиминовым димером, заполняется образовавшийся пробел и сшиваются концы цепи.
У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации или рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, а том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клетки Е. coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительны к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток Е. coli, дефектных по PolI, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.
У представителя низших эукариот Saccharomycescerevisiae имеется по крайней мере пять генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих пяти RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно, и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.
Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к ультрафиолетовому свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.
Генетическая рекомбинация включает несколько связанных между собой процессов, в результате которых в клетках или организмах, где они происходят, создаются новые комбинации элементов носителей генетической информации. Рекомбинация между близко расположенными гомологичными хромосомами приводит к интенсивной перетасовке отцовских и материнских генов в ходе мейоза и тем самым создает предпосылки для эволюционной проверки новых комбинаций этих генов в потомстве. Как правило, рекомбинационные события, происходящие в соматических клетках либо во время репликации ДНК, либо после нее и проявляющиеся в виде обмена сестринских хроматид, не приводят к изменению генотипа или фенотипа клетки. Однако нередко они порождают различные геномные перестройки. Это, например, утрата, приобретение или амплификация генетических элементов и установление новых взаимосвязей между уже имеющимися, но по-новому расположенными элементами.
Если использовать молекулярные термины, то можно сказать, что генетическая рекомбинация состоит в образовании ковалентных связей между нуклеотидными последовательностями из разных областей одной и той же или разных молекул ДНК.
Все клетки и многие вирусы содержат информацию о синтезе ферментов, предназначенных не только для репарации повреждений в собственной ДНК, но и ферментов, осуществляющих рекомбинацию. На самом деле некоторые ферменты, участвующие в репликации и репарации ДНК, играют ключевую роль и при рекомбинации. В этом разделе мы рассмотрим механизмы некоторых рекомбинационных процессов и ферменты, которые их катализируют. Особое внимание будет обращено на рекомбинацию у бактерий и фагов, поскольку у них эти процессы довольно хорошо изучены. Несмотря на то что генетические и морфологические аспекты рекомбинации в эукариотических клетках известны, на молекулярном уровне здесь многое остается неясным.
Существуют три типа рекомбинации: общая, или гомологичная, сайт-специфическая и случайная, или негомологичная.
Общая рекомбинация. Общая рекомбинация происходит, как правило, между протяженными участками идентичных или гомологичных нуклеотидных последовательностей. Ее часто называют гомологичной рекомбинацией или кроссинговером. При общей рекомбинации происходит разрыв двух гомологичных участков ДНК, и каждый из концов одного сегмента соединяется с соответствующими концами другого таким образом, что обе образующиеся молекулы содержат разные фрагменты обеих участвующих в рекомбинации ДНК. На самом деле сайты, по которым происходят разрыв и воссоединение каждой из двух цепей, очень часто не совпадают.
Обычно общая рекомбинация происходит между гомологичными и аллельными участками разных молекул ДНК, но она может произойти и между гомологичными, но неаллельными областями ре-комбинирующих молекул. В этом случае один из продуктов рекомбинации утрачивает часть ДНК, а другой приобретает "лишний" сегмент. Такой процесс получил название неравного кроссинговера. Иногда рекомбинация происходит между неаллельными участками одной и той же хромосомы с соответствующей потерей области, лежащей между сайтами рекомбинации. В отличие от уже рассмотренных случаев некоторые рекомбинационные события нереципрокны; как следствие, один из образовавшихся продуктов идентичен одной из исходных молекул, а другой отличается от обоих партнеров. Такой процесс часто называется генной конверсией.
Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбинация называется сайт-специфической, если сайты разрыва и воссоединения в двух рекомбинирующих молекулах или двух фрагментах одной и той же молекулы ДНК находятся в пределах довольно коротких специфических гомологичных нуклеотидных последовательностей - как правило, не более 25 нуклеотидов. Такие короткие последовательности может иметь только один из партнеров или оба. В качестве примера первого варианта можно привести транспозиции некоторых мобильных элементов у эу - и прокариот, а второго - процесс интеграции-выщепления ДНК фага X из хромосомы Е. coli. С помощью сайт-специфической рекомбинации происходят запрограммированные перестройки хромосомной ДНК при смене типов спаривания у дрожжей; она ответственна также за разнообразие антител. По-видимому, общая рекомбинация между любыми парами гомологичных последовательностей осуществляется с помощью одного и того же комплекса ферментов; с другой стороны, для каждого случая сайт-специфической рекомбинации необходим свой набор ферментов. Негомологичная рекомбинация. Рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих - весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных, в результате чего в реплицирующихся геномах паповавирусов появляется множество делеций и дупликаций. Концы разорванной ДНК могут соединиться, даже если они негомологичны. В некоторых случаях рекомбинация происходит между последовательностями, содержащими несколько гомологичных пар оснований, или между короткими частично гомологичными участками. Но, как правило, рекомбинирующие сегменты не имеют гомологичных последовательностей.
Общая рекомбинация при согласованном внесении разрывов и воссоединении цепей двух спиралей ДНК с образованием протяженных гетеродуплексных областей. Чтобы могла произойти рекомбинация между двойными спиралями, каждая из четырех цепей должна быть разорвана и затем соединена с новым партнером. Соответствующие цепи обоих линейных гомологичных дуплексов ДНК надрезаются и свободные концы одной спирали спариваются с комплементарными участками другой. Перекрест стабилизируется сшиванием концов донорных цепей со свободными концами реципиентных спиралей. Точка перекреста обменивающихся цепей перемещается вдоль спиралей - процесс, называемый миграцией ветви. При этом происходит одновременное расхождение цепей исходных спиралей и их реассоциация с новыми партнерами с образованием дочерних дуплексов. Структуры дие, а также ж называются структурами Холлидея по имени исследователя, впервые их предложившего.
Структуры Холлидея могут переходить в рекомбинантные двойные спирали путем внесения разрыва и воссоединения цепей двумя альтернативными способами. Один способ состоит в разрезании и воссоединении перекрещивающихся цепей. Два реципрокных продукта л и м могут образоваться, если разрыв и последующее воссоединение цепей произойдут в точке перекреста в структурах е и д или по линии пересечения четырех цепей в изомерной структуре Холлидея и. Размер обменивающихся фрагментов зависит от расстояния, на которое произошла миграция ветви до акта рекомбинации. Альтернативные продукты н и о образуются в том случае, если структура Холлидея з переходит в результате разрыва в к.
В основе рекомбинации данного типа лежит гомологичное спаривание цепей, принадлежащих двум разным спиралям ДНК, поэтому скорее всего она произойдет в том месте, где такое спаривание возможно apriori и где гомологичность последовательностей достаточно велика, чтобы могла произойти миграция ветви в рамках структуры со скрестившимися цепями. Отсюда можно понять, почему общая, или гомологичная, рекомбинация происходит также между двумя повторами в пределах одной молекулы ДНК или между аллельными и неаллельными элементами одной и той же последовательности в двух разных хромосомах.
В ходе миграции ветви при спаривании цепей, принадлежащих разным спиралям, образуются гетеродуплексы
. В таких гетеродуплексах в пределах сегмента между сайтом начала образования структуры Холлидея и сайтом кроссинговера может содержаться по одному или более ошибочно спаренных оснований. Они удаляются так же, как любые модифицированные основания при репарации ДНК. Однако, поскольку удалено может быть любое из ошибочно спаренных оснований, в обеих рекомбинантных спиралях в данном сайте могут оказаться одинаковые пары оснований, т.е. рекомбинация для этого сайта окажется нереципрокной. Таким образом, каждая из рекомбинантных спиралей может быть похожа на любой из начальных дуплексов в тех позициях, где исходно они различались.
Общая рекомбинация с образованием двухцепочечного разрыва. Альтернативный механизм общей рекомбинации включает образование двухцепочечного разрыва в одном из дуплексов-партнеров. Далее с помощью экзонуклеаз в месте разрыва образуется брешь. При спаривании 3'-одноцепочечного конца бреши с комплементарной цепью интактной спирали в последней образуется петля. Размер этой петли увеличивается по мере того, как ДНК-полимераза наращивает 3'-конец "вклинившейся" цепи. В итоге другой одноцепочечный конец бреши спаривается с комплементарной последовательностью в перемещающейся петле. В результате такого спаривания образуется система "праймер-матрица", и ДНК-полимераза синтезирует недостающую цепь, заполняя брешь. Лигирование двух растущих концов с исходными цепями приводит к образованию двойной структуры Холлидея. Миграция ветви в одном или обоих перекрестах передвигает оба места сцепления в любом направлении, при этом в участках, фланкирующих брешь, могут возникать ошибки. Разделение таких структур может идти двумя способами - с перекрестом и без него, с образованием четырех дуплексов.
Необходимо отметить некоторые особенности этого механизма. Образование ошибочных пар в районах, фланкирующих брешь, обусловливает получение как реципрокных, так и нереципрокных рекомбинаций между генетическими маркерами. Если двухцепочечный разрыв происходит вблизи участка, где между спиралями имеются различия, то рекомбинанты унаследуют нуклеотидную последовательность партнера, у которого разрыва не происходило. Этот механизм объясняет многие случаи генной конверсии, особенно те, в которых протяженная последовательность одного дуплекса замещается соответствующей, но отличающейся последовательностью другого дуплекса.
Нереципрокная общая рекомбинация используется и при репарации некоторых повреждений ДНК. Например, если тиминовые димеры не были удалены из УФ-облученной ДНК до того, как к ним подошла репликативная вилка, то синтез комплементарной цепи в этом участке не может быть завершен. Поскольку тиминовые димеры, находящиеся напротив бреши, не могут быть выщеплены, остается один путь для спасения хроматиды - использовать генетическую информацию гомологичной сестринской хроматиды и заполнить брешь. Для этого применяется такой же механизм, как для репарации брешей.
В общей рекомбинации участвуют два специфических фермента и еще несколько ферментов, катализирующих также процессы репликации и репарации ДНК. Энзимология общей рекомбинации изучена только для некоторых прокариотических организмов, в частности E. coli и ее фагов. Один из специфических ферментов, необходимых для успешной гомологичной рекомбинации, называется recA-белком. Он катализирует обмен одиночными цепями, используя энергию гидролиза АТР до ADP и неорганического фосфата. RecA-зависимое внедрение одноцепочечных ДНК в дуплекс - первый этап рекомбинационного процесса в рамках обеих схем Холлидея и механизма с образованием двухцепочечных разрывов. Второй фермент, состоящий из трех отдельных субъединиц и поэтому называемый recBCD-нуклеазой, обладает эндо - и экзонуклеазной, а также геликазной активностями. Механизм его действия до конца не установлен, однако известно, что recBCD-нуклеаза индуцирует разрывы в дуплексной ДНК и благодаря присущей ей геликазной активности вместе с recA инициирует рекомбинационный процесс. Идентифицирован также фермент, разрезающий узлы в структурах Холлидея; при его участии образуются липкие концы, соединяемые лигазой.
В общей рекомбинации участвуют также геликазы и белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК; оба они необходимы для обеспечения процесса миграции ветви. Как известно, перемещению цепей во время миграции ветви способствует Pol I, а в воссоединении разорванных цепей участвует ДНК-лигаза. Для снятия топологических ограничений при раскручивании спирали и для распутывания перекрученных структур, по-видимому, нужны топоизомераза типа I и, возможно, гираза.
Сайт-специфическая рекомбинация происходит между специфическими сегментами дуплексов ДНК, не имеющими протяженных гомологичных участков. Характерным примером такой рекомбинации служит интеграция кольцевой ДНК фага X с хромосомой Е. coli и ее обратное выщепление. Несмотря на то что эти рекомбинационные события также включают разрыв и воссоединение двух спиральных сегментов ДНК, их механизм абсолютно отличен от механизма общей рекомбинации. В этом случае рекомбинация происходит в пределах специфической нуклеотидной последовательности ДНК фага X и уникальной последовательности ДНК Е. coli. Нуклеотидные последовательности attP - и attВ-сайтов совершенно различны, хотя имеют общее ядро протяженностью в 15 нуклеотидных пар. AttP простирается на 150 нуклеотидов влево и на 75 нуклеотидов вправо от общего ядра, aattB - это сегмент длиной всего около 25 нуклеотидов, включая и ядро. Рекомбинационные события, происходящие как при интеграции, так и при исключении ДНК фага X из хромосомы Е. coli.
Поскольку нуклеотидные последовательности, фланкирующие attP - и а?? В-сайты слева и справа, для этих сайтов различаются, механизм рекомбинационного выщепления ДНК фага X из ДНК Е. coli должен отличаться от механизма их рекомбинационной интеграции. И действительно, для рекомбинации между attL и attR при исключении фаговой ДНК помимо белка Int необходимы фаговый белок xis и клеточный белок HF. Процесс рекомбинационного выщепления, по-видимому, имеет некоторое сходство с процессом интеграции, но роль указанных трех белков, особенно белка xis, все еще изучается.
Образование РНК-содержащих вирусов происходит путем репликации их РНК, тогда как все клеточные РНК образуются в результате транскрипции ДНК. Здесь мы рассмотрим лишь процесс репликации вирусной РНК как таковой, не касаясь связи репликации с жизненным циклом соответствующих вирусов.
За исключением ретровирусов, репликация РНК в основном повторяет процесс репликации ДНК. Цепи РНК также удлиняются на один нуклеотид за один акт в направлении 5'->3' путем присоединения рибонуклеотидтрифосфата к 3'-ОН-концу растущей цепи. Как и при репликации ДНК, порядок расположения нуклеотидов определяется комплементарным копированием матрицы, в данном случае обязательно цепи РНК. Ферменты, осуществляющие этот процесс, называются РНК-зависимыми репликазами.
РНК бактериальных вирусов R17 и MS2, а также полиовирусов и вируса Синдбис, инфицирующих животных, всегда обозначается знаком, поскольку последовательность их РНК-геномов идентична последовательности мРНК. Таким образом, геном инфицирующего вируса может служить в качестве мРНК и содержит информацию о синтезе некоторых, если не всех, вирусных белков. Специфическая репликаза, кодируемая геномом вируса и образующаяся вскоре после инфекции, связывается с одним или несколькими белками клетки-хозяина и инициирует процесс копирования - цепи с ее 3'-конца с образованием полной - цепи, ассоциированной с - цепью-матрицей. Затем та же репликаза, возможно вместе с другими вирусными белками, синтезирует множество копий - цепи РНК, используя новосинтезированную цепь в качестве матрицы. С единственной - матричной цепи РНК синтезируется одновременно несколько новых - цепей. У многих вирусов копирование - или - цепей инициируется путем спаривания рибонуклеозидтрифосфата с первым нуклеотидом на 3'-конце матричной цепи.
Цепь РНК полиовируса реплицируется способом, аналогичным представленному, но его геномная РНК имеет одну особенность - к ее 5'-концу с помощью фосфодиэфирной связи присоединен белок через тирозиновый остаток. У - цепи, синтезируемой в первом раунде репликации, этот белок отсутствует. Однако все цепи, образующиеся на цепи как на матрице, содержат 5'-концевой белок, даже когда их длина еще очень мала. Это позволяет предположить, что репликаза полиовирусов использует гидроксильную группу тирозина в качестве праймера при инициации новых - цепей, в то время как - цепи фермент может инициировать denovo.
Геном некоторых вирусов представлен одной цепью РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна, а не идентична последовательности мРНК. Такие геномы обозначают знаком. Существуют также вирусы, геном которых состоит из множественных - цепей РНК, при этом каждый такой сегмент соответствует одному или двум вирусным генам. Если геном вируса представлен одной или более - цепями РНК, то в самом вирионе содержится комплекс геномной РНК со специфической репликазой. После проникновения в клетку комплекс активируется, и на - цепях как на матрицах синтезируются - цепи. Новосинтезированные - цепи играют роль мРНК для синтеза новых или дополнительных репликационных белков и роль матрицы при синтезе дочерних - цепей.
Геном некоторых вирусов представлен двухцепочечной РНК, содержащей и - , и - цепи. Репликация у таких вирусов также инициируется ферментами, содержащимися в самом вирионе. Эти ферменты копируют - цепь дуплекса РНК консервативным путем - цепи отделяются). Белки-репликазы, транслируемые с этих - цепей мРНК, синтезируют затем комплементарные - цепи, которые, объединяясь с - цепями, образуют дочерние двухцепочечные РНК вируса.
Имеющиеся данные о структуре и функции РНК-репликаз весьма ограниченны. Наиболее детально изучена РНК-репликаза, синтезируемая РНК-содержащим колифагом Qp. Она состоит из четырех идентичных полипептидов, причем только один из них кодируется вирусным геномом. Этот полипептид не способен реплицировать - цепи вируса, он может катализировать только ограниченную реакцию присоединения рибонуклеотидов. Остальные три белка, входящие в состав РНК-репликазы фага QP, являются компонентами хозяйского аппарата синтеза белка, и их точная функция в процессе репликации РНК неизвестна. Инициация и репликация, осуществляемые РНК-репликазой, кодируемой вирусами животных, также зависит от активности белков, образуемых клеткой-хозяином. Отличительная особенность РНК-репликаз состоит в их необычной способности специфически узнавать нуклеотидные последовательности на 3'-концах как и цепей, что гарантирует инициацию синтеза новых цепей.
|
